影响酶促反应的因素非常多，常见的主要有酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。对酶促反应速度及其影响因素进行定量研究的学科称为酶促反应动力学（kinetics of enzyme-catalyzed reaction）。该研究对于研究酶的结构与功能的关系、酶在物质代谢中的作用、药物和毒物的作用机制以及临床应用均有重要意义。

在其他因素不变的情况下，底物浓度［S］的变化对于酶促反应速度的影响呈矩形双曲线状（图3-6）。

底物浓度对酶促反应速度的影响可用中间产物学说进行解释。该学说认为，酶促反应中酶（E）先与底物（S）结合成不稳定的中间产物ES，然后分解生成终产物（P）和游离的酶，酶促反应速度由中间产物ES的浓度决定。

①在底物浓度很低时，底物的量是限制酶促反应的重要因素，此时若增加底物浓度，剩余的酶将与增加的底物结合，使中间产物ES大大增加，进而使反应速度加快，两者呈正比关系，表现为一级反应模式；②当底物浓度持续增大，反应体系中剩余的酶较少，此时再增加底物的浓度也不能使中间产物ES的生成量大量增加，故反应速度的增加变慢；③当底物浓度继续增加达到一定程度后，所有酶活性中心均被底物饱和，都已与底物结合为ES。若再增加底物浓度，已无剩余的酶与之结合，ES的生成量再也不能增加，反应速度达到最大反应速度（V _max）并趋于恒定。此时，酶促反应的速度不受底物浓度增加的影响，表现为零级反应状态，所有的酶都存在饱和现象，只是达到饱和时所需底物浓度各不相同。

根据中间产物学说可列出单底物酶促反应的通式。式中k ₁、k ₂和k ₃分别为各向反应的速度常数。

1913年，Leonor Michaelis和Maud L. Menten根据中间产物学说进行推导，首次用数学方程式的形式演示了单底物酶促反应当中反应速度与底物浓度之间的数量关系，即著名的米-曼氏方程式，简称米氏方程式（Michaelis equation）。

式中V _max为最大反应速度（maximum velocity）；［S］为底物浓度；K _m为米氏常数（Michaelis constant）；V是不同［S］时的反应速度。当底物浓度很低时，［S］＜＜K _m， ［S］，反应速度与底物浓度成正比。当底物浓度很高时，［S］＞＞K _m，此时V≈V _max，反应速度达最大速度，再增加底物浓度也不影响反应速度。

将米氏方程式进行整理，可转变为（V _m-V）（K _m+［S］） =V _m•K _m，该式与矩形双曲线的函数式［（a-x）（b+y） =常数］完全一致。这就从数学上证明了V-［S］曲线确实属于矩形双曲线范畴。

米-曼氏方程式的推导基于两个前提：①测定的反应速度为初速度，反应刚开始时，产物生成量极少，可以不考虑逆反应；②［S］远远大于［E］，因此在反应的初始阶段，［S］的变化可以忽略不计。

米-曼氏方程式推导过程如下：

反应中游离酶的浓度为总浓度减去结合到中间产物的酶的浓度，即［游离酶］= ［E］-［ES］。

这样ES生成的速度为：

ES分解的速度：

当反应处于稳态时，ES的生成速度=ES的分解速度，即

整理得：

令 ，K _m即为米氏常数，

则［E］［S］-［ES］［S］=K _m［ES］

由于反应速度取决于单位时间内产物P的生成量，所以V=k ₃［ES］

将式（3）代入得：

当底物浓度很高，所有的酶都与底物生成中间产物（即［E］=［ES］）时反应达到最大速度。即

将式（5）代入式（4），得米氏方程式：

必须明确的是，米氏方程对于了解底物浓度、酶浓度与反应速度之间的动力学关系有一定的意义，但也有它的局限性。比如，它只适用于单底物的一般酶促反应，并不能说明多底物参与的酶促反应或者一些变构酶催化的酶促反应当中反应速度随底物浓度的变化规律。

当V=1/2V _max时，米氏方程式可变换为： ，整理得：K _m=［S］。由此表明：K _m值等于酶促反应速度达到最大反应速度1/2时的底物浓度，且K _m的单位是与［S］一样的浓度单位，一般用mol/L或mmol/L表示。

（1） K _m值可表示酶与底物的亲和力。在方程式推导的过程中，设 。当k ₂＞＞k ₃时，即ES解离成E和S的速度大大超过分解成E和P的速度时，k ₃可以忽略不计。此时K _m值近似于ES的解离常数K _s（K _s反映ES的解离趋势）。在这种情况下，K _m值可用来表示酶对底物的亲和力。

K _m值愈大，酶与底物的亲和力愈小；K _m值愈小，酶与底物的亲和力愈大，表示不需要很高的底物浓度便可达到最大反应速度。但并非在所有酶促反应中k ₃值都远小于k ₂，所以K _m值的含义与K _s仍有所不同，不能完全互相代替。

（2） K _m值是酶的一个特征性常数。不同酶的K _m值不同；同一种酶与不同底物作用，也表现出不同的K _m值，其中K _m值最小的底物称为该酶的最适底物或天然底物。K _m值是酶的特征性常数之一，可作为鉴别酶的一种参数。

（3） 催化可逆反应的酶，对正逆两向反应底物的K _m值往往是不同的。K _m小的底物所示方向是该酶催化的优势方向。测定这些K _m值的差别及细胞内正逆两向反应底物的浓度，对了解酶的主要催化方向及生理功能有重要意义。

酶促反应的最大速度是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。即：V _max=k ₃［E］，V _max不是酶的特征性常数。

为酶完全被底物饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数，称为酶的转换数。如果酶的总浓度已知，可通过V _max计算k ₃。例如，10 ^-6mol/L的碳酸酐酶溶液在底物过饱和的情况下1秒钟可催化生成0.6mol/L H ₂CO ₃，则每秒钟每1分子酶可在1秒钟内催化生成6.0×10 ⁵个分子的H ₂CO ₃。酶的转换数可用来表示酶的催化效率。

以米氏方程式直接作图，底物浓度与反应速度的关系表现为矩形双曲线。理论上曲线当中纵坐标为V _max/2处的数据点所对应的横坐标数值即为K _m值，但实际上由于V _max是渐近性的极限值，在作图上易受主观因素的影响，很难准确地测得K _m值和V _max值。为了更方便而且准确地用图解法求得K _m值和V _max值，测定过程中需对米氏方程式进行某种变换，将曲线作图改为直线作图。以下是两种非常经典的米氏方程变形策略：

又称为林-贝氏作图法（Lineweaver-Burk plot），顾名思义，将米氏方程式等号两边各取倒数，即可得到相应的直线方程。该法最为简便，也是最常用的作图方法。

以1/V对1/［S］作图，得一直线，其斜率为K _m/V _max，纵轴上的截距为1/V _max，横轴上的截距为-1/K _m（图3-7）。双倒数作图法求值简便，准确度有所提高，并可用于区分可逆性抑制作用的类型，是在实际工作中常使用的方法之一。但由于在实际操作过程中，各数据点在图上分布往往不均匀，仍存在一定误差。

米氏方程式两边乘以［S］得下列方程式：

以［S］/V对［S］作图，横轴上的截距为-K _m，直线的斜率为1/V _max（图3-8）。此法克服了双倒数作图法当中由于以1/［S］为横坐标而导致的数据点分布不均等问题，因而得到的K _m准确度较高，是比较理想的方法。

从某种意义来说，酶浓度对于反应速度的影响与底物浓度是完全一致的。当然，由于在常规酶促反应体系中，底物浓度往往远大于酶的浓度，此时酶被底物饱和，酶促反应速度与酶浓度呈正比关系，即V=k ₃［E］，而这也是酶的定量测定的基础。

化学反应的速度往往会因温度的波动而发生明显的变化，酶促反应也不例外。温度对于酶促反应具有双重影响：一方面，在较低温度范围内，温度的升高可提高反应体系中底物分子总体的自由能级水平，降低反应的活化能，加快酶促反应速度；另一方面，酶的化学本质是蛋白质，在相对较高的温度范围内升高温度将会导致其空间结构稳定性降低，活性下降，进而增加酶分子变性的几率。一般情况下，环境温度较低时，温度升高加快反应速度这一效应起主导作用，温度每升高10℃，反应速度往往可加快1～2倍；当温度升高到60℃以上，酶分子开始变性；到80℃时，变性已不可逆，反应速度则因酶的变性而明显降低（图3-9）。

综合上述两方面因素，酶只在一定温度范围内表现较大的催化活性。使酶促反应速度达到最大时的反应体系温度称为酶作用的最适温度（optimum temperature）。不同种属动物体内酶分子最适温度各不相同，温血动物组织中酶的最适温度一般在35～40℃，而对于生活在温泉或深海中的细菌，酶的最适温度则较高。例如，聚合酶链反应技术中所需的具有热稳定性的DNA聚合酶即是从生活在70～80℃的栖热水生菌中提取的，该酶可耐受近100℃的高温。

酶的最适温度并不是酶的特征性常数，常受到其他条件，如底物种类、反应持续时间、pH和离子强度等因素的影响。

温度对酶促反应速度的影响在临床上具有重要的理论指导意义。低温条件下，酶的活性降低，但酶并没有被破坏，一旦温度回升，酶的活性便又恢复。临床上，低温麻醉及抢救重症患者时用的亚冬眠疗法及物理降温，均是依据酶活性随温度下降而降低的性质，以减慢细胞代谢速度，提高机体对氧及营养物质缺乏的耐受性，有利于手术治疗和患者度过疾病的极期。实验室低温保存菌种及生物制剂也是基于这个原理。

酶分子属于两性电解质，不论是酶分子还是其内部各侧链基团的电离均会受到环境pH值的影响。由此，环境pH的变化不仅影响酶分子空间结构的稳定性，而且还可改变酶分子内基团的解离状态，特别是酶活性中心上必需基团以及底物分子和辅酶（如NAD ⁺、CoASH、氨基酸）的解离状态，从而影响酶与底物的相互作用。然而酶活性中心的必需基团、辅酶和底物只有处于某一解离状态时才能实现最佳的结合，表现出最大的反应速度。例如，蛋清溶菌酶活性中心的Glu ₃₅和Asp ₅₂协同催化底物的糖苷键水解，只有当Asp ₅₂的羧基处于电离状态（稳定底物的正碳离子），Glu ₃₅羧基处于非电离状态（提供质子进行酸碱催化作用）时才能发挥催化作用。因此，酶分子只在一定的pH范围内，表现出较高的底物亲和力以及催化活性（图3-10）。其中，酶催化活性最大时的环境pH称为酶的最适pH（optimum pH）。

不同酶的最适pH不同，生物体内大多数酶的最适pH接近中性，但也有例外。如胃蛋白酶的最适pH为1.8，精氨酸酶的最适pH为9.8。临床上用酸性溶液配制胃蛋白酶合剂就是依据这一特点。

最适pH也不是酶的特征性常数，受底物浓度、酶的纯度和缓冲液的种类与浓度等多种因素的影响。溶液的pH高于或低于最适pH时，酶的活性都会降低，偏离酶的最适pH太远甚至会导致酶的变性、失活。因此，在测定酶的活性时，应选用适宜的缓冲液以保持酶所作用的环境pH的相对恒定。

凡能够选择性地使酶的催化活性下降或丧失而不引起酶蛋白变性的物质统称为酶的抑制剂（inhibitor）。抑制剂多与酶活性中心内、外的必需基团结合，直接或间接作用于酶的活性中心，从而抑制其催化活性。除去抑制剂后，酶仍可恢复其原有的活性。各种物理或化学因素可通过无选择性地使酶蛋白变性而导致其失活，这些都不属于酶抑制剂的范畴。

根据抑制剂与酶结合的紧密程度及作用方式，可将抑制作用分为不可逆抑制性和可逆性抑制两大类。

有些抑制剂可以共价键与酶分子活性中心的必需基团结合，使酶失活，称为酶的不可逆性抑制作用（irreversible inhibition）。所谓“不可逆”是指与酶结合的抑制剂不能用稀释、透析、超滤等简单物理方法除去，但并非绝对不可逆转，用某些特定的化学方法去掉抑制剂后，酶活性尚可恢复。

不可逆性抑制作用有专一性与非专一性之分。专一性是指具有专一化学结构并带有一个活跃基团的类底物，如有机磷农药、沙林毒气［即二异丙基氟磷酸（DFP），一种神经毒气］等。非专一性是指抑制剂对酶分子中氨基酸进行共价修饰而导致酶失活，如三价砷、重金属Pb ²⁺等。

专一性抑制是抑制剂选择性地与酶活性中心内的某种必需基团以共价键形式结合。有机磷农药敌百虫、敌敌畏、1605、1059等即属此类抑制剂，它们可特异地与胆碱酯酶（choline esterase，CE）活性中心的丝氨酸羟基以酯键结合而使之失活，因而导致胆碱能神经末梢分泌的乙酰胆碱不能及时分解而发生堆积，引起胆碱能神经过度兴奋，表现出恶心、呕吐、出汗、流涎、腹痛、腹泻，甚至惊厥、昏迷等一系列中毒症状。

对于有机磷化合物中毒，临床上常通过药物置换的方式解除有机磷化合物对羟基酶的抑制作用。解磷定（pyridine aldoxime methyliodide，PAM）与有机磷农药有很高的亲和力，可使羟基酶与有机磷农药分离而恢复酶活性，是常用的有机磷农药解毒剂。阿托品能清除或减轻毒蕈碱样和中枢神经系统症状，改善呼吸中枢抑制。

非专一性抑制是指抑制剂与酶分子上的某些基团（如—SH）结合从而抑制酶的活性，且这些抑制剂所结合的并不仅局限于酶分子的必需基团。属于此类抑制剂的有：路易士气、重金属离子（Ag ⁺、Hg ²⁺、Cu ²⁺）和乙二胺四乙酸（EDTA）等。

化学毒剂路易士气（lewisite）是一种含砷的化合物，可与酶分子的巯基进行不可逆的结合使酶失活导致机体中毒。

临床上可用二巯丙醇（british anti-lewisite，BAL）、二巯丁二酸钠等含活泼巯基的化合物解毒。这类药物有2个—SH，在体内达到一定浓度后，可与路易士气抑制剂结合，使酶分子上的巯基还原，从而使酶恢复活性。除此之外，低浓度的重金属离子Hg ²⁺、Ag ⁺、As ³⁺等均可与酶的活性巯基结合而使酶失活，BAL均可使其解毒，故被称为“万能解毒剂”。

抑制剂以非共价键与酶和（或）酶-底物复合物可逆地结合，使酶活性降低或丧失。这种结合较为疏松，可用超滤、透析等物理方法将抑制剂除去，使酶恢复催化活性，故称为酶的可逆性抑制作用（reversible inhibition）。

根据抑制剂、底物与酶三者相互作用方式，可逆性抑制可分为以下3种类型。

竞争性抑制剂与底物分子具有一定的结构相似性，将与底物竞争酶活性中心上的同一结合部位，从而阻碍底物与酶之间的结合，这种抑制作用称为竞争性抑制作用（competitive inhibition）。由于抑制剂、底物与酶的结合均可逆，所以抑制的程度取决于体系中抑制剂与底物浓度的相对大小以及两者与酶之间亲和力的差别。加大底物浓度可以减弱甚至消除竞争性抑制对于酶促反应的影响，这是竞争性抑制的重要特征。丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用是竞争性抑制作用的典型实例。琥珀酸脱氢酶可催化琥珀酸脱氢反应，与琥珀酸结构类似的丙二酸或戊二酸均为琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制剂。酶对丙二酸的亲和力远大于酶对琥珀酸的亲和力，当丙二酸的浓度仅为琥珀酸浓度的1/50时，酶的活性便被抑制50%。若增大琥珀酸的浓度，此抑制作用可被削弱。

有抑制剂存在时，同时存在两种反应：

从反应式可知，酶与抑制剂结合形成的复合物EI不能再与底物结合。K _i是EI的解离常数，这里称作抑制常数。米氏方程式的推导方法可衍化出竞争性抑制剂、底物和反应速度之间的动力学关系，其双倒数方程式如下：

在抑制剂存在条件下，以1/V对1/［S］作图（图3-11），可得出与无抑制剂情况下不同斜率的直线图形。从图中可见，无论竞争性抑制剂存在与否，直线在纵轴上的截距 均相同，即最大反应速度（V _max）不变。V _max不变是因为增加［S］可以使抑制作用逐渐减弱直至消除，故而此抑制作用并不能改变酶促反应的最大速度。但是随着竞争性抑制剂的存在可使得曲线的斜率增大，横轴上的截距所代表的表观K _m值增大，即酶对底物的亲和力下降了，此时需要更高的底物浓度才能达到最大反应速度。

竞争性抑制作用的原理可用来解释某些药物的作用机制并指导进一步探索合成控制代谢的新药。磺胺类药物就是这类药物当中的典型代表。对磺胺类药物敏感的细菌在生长繁殖时，不能直接利用环境中的叶酸，而是以对氨基苯甲酸（PABA）等为底物在菌体内二氢叶酸合成酶的催化下合成二氢叶酸。二氢叶酸则进一步被还原成为四氢叶酸，是核苷酸合成过程中必不可少的辅助因子。磺胺类药物的化学结构与对氨基苯甲酸十分相似，故能与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶的活性中心，抑制二氢叶酸的合成；磺胺增效剂TMP的结构与二氢叶酸相似，是二氢叶酸还原酶的竞争性抑制剂，它与磺胺药配合使用，可使细菌的四氢叶酸合成受到双重阻断作用，因而严重影响细菌的核酸及蛋白质的生物合成，导致细菌死亡。人类能直接利用食物中的叶酸，所以核酸的合成不受磺胺类药物及其增效剂的影响。根据竞争性抑制作用的特点，服用磺胺类药物时必须保持血液中药物的高浓度，才能发挥其有效的竞争性抑菌作用。

此外，许多化疗药物，如甲氨蝶呤（MTX）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、6-巯基嘌呤（6-MP）等，都是酶的竞争性抑制剂，它们分别抑制四氢叶酸、脱氧胸苷酸及嘌呤核苷酸的合成，以达到抑制肿瘤生长的目的。

有些抑制剂并不与底物争夺酶的活性中心，而是与酶活性中心外的必需基团可逆性结合，酶-底物复合物形成与酶-抑制剂的结合互不影响，两者之间无竞争关系，但生成的酶-底物-抑制剂复合物（ESI）不能进一步释放出产物。这种抑制作用称为非竞争性抑制作用（non-competitive inhibition），其反应式如下：

按照米氏方程式的推导方法，非竞争性抑制剂作用的动力学方程式如下：

以双倒数作图法作图，可发现与无抑制剂时相比，非竞争性抑制作用的图形是具有更大斜率的直线，在纵轴上的截距 增大（图3-12），这说明酶促反应的V _max因抑制剂的存在而降低，降低的幅度与抑制剂的浓度相关，且无法通过增加底物浓度的办法来减轻或解除这种抑制作用；而在横轴上的截距 与无抑制剂时相同，这说明非竞争性抑制作用不改变酶促反应的表观K _m值。例如，亮氨酸抑制精氨酸酶就是一种非竞争性抑制作用。

与上述两种抑制作用不同，有些抑制剂只能与酶-底物复合物结合，从而抑制酶的活性。整个过程中，底物的存在是抑制剂与酶结合的先决条件。此类抑制剂的存在，不仅不影响酶与底物的结合，反而可提高两者之间的亲和力，促进两者之间的相互结合，这与竞争性抑制作用相反，故称为反竞争性抑制作用（uncompetitive inhibition）。其机制在于酶与底物诱导契合后，酶分子空间结构改变，暴露与抑制剂结合的部位，从而与抑制剂结合形成ESI复合物，使中间产物ES的量下降。这样，既减少从中间产物转化为产物的量，又减少从中间产物解离出游离酶和底物的量。这种抑制作用常见于多底物反应中，在单底物反应中比较少见。

其抑制作用的反应过程如下：

其双倒数方程及其图像如下：

由图3-13可见，反竞争性抑制作用动力学特点在于表观K _m和V _max都降低。前者因为抑制剂与酶的结合使酶与底物的亲和力增大；后者由于与抑制剂结合的酶失去了催化作用，增加底物浓度不但不能解除抑制，反而使抑制增强。

三种可逆性抑制作用的主要特点见表3-4。

凡是具有一定特异性的、能使酶从无活性变为有活性或使酶活性增加的物质统称为酶的激活剂（activator）。按激活剂对酶活性的影响程度，将其分为必需激活剂和非必需激活剂两大类。

有些激活剂是酶促反应进行必不可少的，实际上这类激活剂往往本身就是酶的一部分（辅助因子），这类激活剂称为必需激活剂（essential activator）。若无必需激活剂存在，酶分子将无法表现出催化活性。大多数必需激活剂是金属离子。例如，Mg ²⁺是己糖激酶及其多种激酶的必需激活剂。ATP是这些激酶的底物，但酶不能直接与ATP结合，而只能与Mg ²⁺和 ATP的复合物Mg ²⁺-ATP结合。所以，只有在Mg ²⁺存在时，酶才能发生催化作用。

有些激活剂不存在时，酶仍有一定的催化活性，但催化效率较低，加入激活剂后，反应速度大大加快，这类激活剂称为非必需激活剂（non-essential activator），又称酶的激动剂。它们主要通过与酶、底物或酶-底物复合物结合以提高酶的催化活性。属于此类激活剂的有某些金属离子及一些有机或无机阴离子，如I ^-对胰脂肪酶以及Cl ^-对唾液淀粉酶的激活作用。