第1节　碱裂解法提取质粒DNA

质粒是存在于染色体DNA外的、能够独立复制的小分子DNA，其长度有数千个碱基对（kb）。细菌质粒是重组DNA技术中常用的基因运载工具。质粒的提取纯化技术是最常用、最基本的实验技术，碱裂解法是最常用的少量制备质粒DNA的方法。

一、实验目的

自大肠杆菌（E.coli）菌株中分离纯化质粒。学习利用碱裂解法使菌体分解或破碎释放出质粒DNA，再以酚/氯仿萃取、乙醇将DNA沉淀，获得质粒DNA分子。

二、实验原理

碱裂解法提取分离E.coli质粒DNA的原理是利用碱裂解菌体，并使质粒DNA及染色体DNA变性，打开双螺旋链呈单股状态再加酸中和，染色体DNA因分子过大无法恢复配对并与其他分子如蛋白等沉淀下来。质粒DNA分子小很快恢复DNA原碱基配对而溶于水中，通过离心作用，即可将染色体DNA与质粒DNA分离。加入溶液Ⅰ的目的主要是将细菌团块重新悬浮于缓冲溶液中并兼有破壁作用，溶液Ⅱ含有SDS及NaOH，前者可将细菌溶解，后者可使DNA变性，溶液Ⅲ是由醋酸及钾盐组成的，前者在于中和碱，后者则与DNA形成复合物而有利于DNA的沉淀。加入溶液Ⅲ后离心，大部分的蛋白质与染色体DNA会留在下面的有机层，而上层的水层所含的质粒DNA可用乙醇沉淀，或酚/氯仿/异戊醇萃取去除残留蛋白质，氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可以消除抽提过程中出现的泡沫，70%乙醇洗涤除盐。

三、材料、试剂与仪器

1.实验材料

实验前一天，将含pET-28a质粒的E.coli DH5α菌株接种至3mL含卡那霉素50μg/mL的LB培养液中，并在37℃下振荡培养过夜。

2.实验试剂

溶液Ⅰ（GTE溶液）：25mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）、10mmol/L EDTA（pH 8.0）、50mmol/L葡萄糖，121℃、高压灭菌15min，贮存于4℃。

溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH，1% SDS（使用前以10mol/L NaOH与10% SDS稀释配制）。

溶液Ⅲ：3mol/L醋酸-醋酸钾溶液（pH 5.2），4℃保存备用。

其他：LB培养液、1mg/mL RNase A溶液、TE缓冲溶液、苯酚/氯仿/异戊醇（三者体积比为25∶24∶1）、无水乙醇或异丙醇、70%乙醇、100mg/mL卡那霉素母液。

3.实验仪器

高压灭菌锅、微量移液器（20μL，200μL，1000μL）、涡旋振荡器、恒温水浴锅、超净工作台、台式离心机、微量离心管、真空干燥机及NanoDrop 2000C超微量分光光度计。

四、实验步骤

（1）将过夜培养菌液分别倒入1.5mL微量离心管中，以6000r/min离心2min后，弃上清液。

（2）沉淀菌体加入100μL预冷的溶液Ⅰ，涡旋振荡器剧烈振荡，使菌体完全悬浮，室温放置5min。

（3）加入200μL溶液Ⅱ，盖上管盖后将离心管反复上下颠倒数次（不可振荡），室温放置5min。

（4）加入150mL溶液Ⅲ，亦温和摇匀，室温放置5min。

（5）以12000r/min（13400g）离心10min，小心吸取上清液至另一离心管中。

（6）加入等量的苯酚/氯仿/异戊醇（约350μL），振荡混合有机相和水相，然后12000r/min离心10min，将上清转移至一新离心管中。

（7）加入2倍体积无水乙醇，混合均匀，-20℃放置30min。

（8）12000r/min离心10min，小心弃上清液，加入1mL 70%乙醇洗涤沉淀，12000r/min离心2min，弃上清液。

（9）将开口的离心管置于超净工作台，吹干乙醇。

（10）加入2μL的RNase A溶液，加入20μL的TE缓冲液溶解，37℃放置20min，-20℃保存。

五、结果与分析

pH 7～8.5和低离子浓度的条件下（如10mmol/L的Tris-HCl缓冲液，pH 8.0）测定A₂₆₀/A₂₈₀比值在1.6～1.9，低于1.6说明有蛋白质、酚等污染，高于1.9有RNA污染，大于2.0可能被异硫氰酸胍污染，公认纯DNA为1.8。A₂₆₀/A₂₃₀比值在2.0～2.5，小于2.0表明样品被糖类、盐类或有机溶剂污染。也可用琼脂糖凝胶电泳方法检测所提取DNA的情况。

六、注意事项

（1）收集菌体提取质粒DNA前，培养基要去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮。

（2）在添加溶液Ⅱ和溶液Ⅲ后采用上下颠倒的柔和混合方法，不要在振荡器上剧烈振荡，以免污染基因组DNA。其中加入溶液Ⅱ后，溶液变澄清，并有黏性，加入溶液Ⅲ后，出现絮状沉淀。

（3）配制酚/氯仿溶液过程中，吸取酚溶液时，注意吸取下层，上层为酚饱和的水溶液，下层为水饱和的酚溶液。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。苯酚能造成皮肤的严重烧伤及衣物损坏，使用时应注意小心操作。如果不小心皮肤上碰到苯酚则应用碱性溶液、肥皂及大量的清水冲洗。

（4）苯酚/氯仿/异戊醇溶液分上下两层，上层是隔绝空气作用的Tris-HCl液，所以应取下层溶液。

（5）采用有机溶剂（苯酚/氯仿/异戊醇）抽提时，应充分混合。经苯酚/氯仿抽提后，吸取上清液时注意不要把中间的白色层吸入，其中含蛋白质等杂质。

（6）如果用异丙醇沉淀DNA时，盐等杂质易下沉，所以沉淀要在室温下进行，并且时间不宜过长，限于20min以内。沉淀离心后，还要用70%乙醇洗涤，以除去盐类及挥发性小的异丙醇。

（7）有些质粒本身可能在某些菌种中稳定存在，但经过多次转接有可能造成质粒丢失。因此，不要频繁转接，每次接种时应挑单菌落。

七、思考题

质粒DNA提取过程中是如何与染色体DNA实现分离的？

（刘长霞）