第5节 RNA的分离提取
DNA、RNA和蛋白质是三种重要的生物大分子，是生命现象的分子基础。RNA是由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成的长链状分子。DNA的遗传信息决定生命的主要性状，而mRNA在信息传递中起很重要的作用。rRNA和tRNA在蛋白质的生物合成中也发挥着不可替代的重要功能。因此，mRNA、rRNA、tRNA在遗传信息由DNA传递到表现生命性状的蛋白质的过程中起着举足轻重的作用。另外，RNA是存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。
RNA种类繁多，大家熟悉的信使RNA分子，可以作为模板翻译成蛋白质；rRNA、tRNA等，参与构成细胞器的基本结构；微RNA是一类长度在20～22nt的小RNA分子，可以通过互补配对，结合到mRNA上，参与基因调控过程；此外，生物体中还存在大量长链非编码RNA分子，它们参与到细胞分化、癌症发生、端粒长度维持等多个生物学过程中。RNA分子作为中心法则中的重要一员，发挥着重要的作用。
细胞内总RNA的制备方法很多，AGPC法（acid guanidinium thiocyanate/phenol/chloroform，异硫氰酸胍/苯酚/氯仿）是比较常用的方法。许多公司有现成的总RNA提取试剂盒，可快速有效地提取到高质量的总RNA。TRIZOL就是一种新型的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞、抑制细胞释放出的核酸酶。细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时，核糖体上的蛋白质变性，核酸释放。释放出来的DNA和RNA由于在特定pH值下溶解度的不同，而分别位于整个体系的中间相和水相，从而得以分离，经有机溶剂抽提、沉淀，得到纯净的RNA。
目前RNA提取分离技术在国内外得到广泛应用，特别是qPCR检测、RNA测序、RNA修饰和RNA芯片等方向［11～16］，都是基于RNA提取技术基础之上的新型研究领域，可用于检测基因转录水平上的调控，在克隆基因、调节基因的基础上，对基因进行干扰、增强、取代以及重组，在分子生物学领域发挥着关键性作用。
一、实验目的
（1）了解提取RNA的技术与操作规则。
（2）学习和掌握利用TRIZOL法提取RNA的基本原理和方法。
二、实验原理
TRIZOL试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚，其中异硫氰酸胍可裂解细胞，促使核蛋白体解离，使RNA与蛋白质分离，并将RNA释放到溶液中，当加入氯仿时，它可抽提酸性的苯酚，而酸性苯酚可促使RNA进入水相，离心后可形成水相层和有机层，这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开，水相层（无色）主要为RNA，有机层（黄色）主要为DNA和蛋白质。
三、材料、试剂与仪器
1.实验材料
三孢布拉氏霉菌。
2.实验试剂
提取RNA所需试剂：液氮、TRIZOL试剂、氯仿、异丙醇、70%乙醇、纯水。
核酸电泳验证试剂：琼脂糖、5×TBE溶液（配制方法见附录Ⅲ）、溴化乙锭（EB）。
3.实验仪器
核酸电泳仪、凝胶成像仪、研钵、漩涡混合仪、冷冻离心机、EP管、微量移液器（200μL、1000μL）。
四、实验步骤
（1）发酵100mL三孢布拉氏霉菌后，用纱布过滤掉发酵液，留下菌体。
（2）加入液氮，预冷研钵，将菌体放入研钵中充分研磨到无明显颗粒。
（3）佩戴口罩，加入TRIZOL试剂1mL，继续研磨至无明显颗粒（保持研钵中一直有液氮）。
（4）将研磨成粉末状的TRIZOL和组织混合物转移到EP管中。
（5）加入0.2mL氯仿到EP管中，漩涡混匀。静置5min。
（6）在冷冻离心机中（4℃）13000r/min离心15min。
（7）此时EP管中分为三层。吸取上清液，注意不能吸取到中间相或下层有色相，加入等体积的异丙醇，混合均匀，室温沉淀15～20min或放置-20℃沉淀过夜。
（8）在冷冻离心机中（4℃）13000r/min离心15min，小心丢弃上清液，如果RNA含量高，能在管底看到乳白色沉淀。
（9）用70%乙醇洗涤白色沉淀，在冷冻离心机中（4℃）13000r/min离心15min。
（10）小心弃去上清液。将EP管盖打开放置2min，让乙醇挥发。
（11）加入30μL纯水。
（12）对提取产物进行检测，用1×TBE溶液配制1%的琼脂糖凝胶，加入万分之一EB，在TBE溶液中进行凝胶电泳，检测产物是否正确。
具体实验步骤如图1-4所示。
图1-4 提取RNA过程示意图
五、结果与分析
1.实验结果
三孢布拉氏霉菌的RNA提取结果如图1-5所示。
图1-5 RNA提取结果琼脂糖凝胶电泳图
2.问题及可能原因分析
（1）出现RNA条带弥散：没有佩戴口罩、手套（人的唾液和空气中含有RNA酶，能够促进RNA降解），或者提取操作不熟练导致实验时间过长，或者实验用品没有进行二次灭菌。
（2）不同组织或细胞RNA提取得率低：样品裂解或匀浆处理不彻底或者最后得到的RNA沉淀未完全溶解。
（3）A260/A280<1.65：检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下A280会较高，或者样品匀浆时加的试剂量太少，也可能是匀浆后样品未在室温放置5min，水相中混有有机相。
六、注意事项
（1）经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致RNase污染。
（2）使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
（3）RNA在TRIZOL试剂中不会被RNase降解。但提取后继续处理过程中应使用不含RNase的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在150℃烘烤4h，塑料器皿可在0.5mol/L NaOH溶液中浸泡10min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除RNase。
（4）配制溶液应使用无RNase的超纯水。
七、思考题
如何评判核酸分离纯度？
（袁其朋）